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Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase
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Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase

貨  號:
P501-d1/d2/d3
價  格:
340.00
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Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase

卓越保真度和擴增能力的高保真DNA 聚合酶

保真度是Taq DNA Polymerase的52倍,是Pfu DNA Polymerase的6倍

擴增速度是常規聚合酶的4-150倍

廣泛的模板適應性

優化的緩沖體系廣泛適用于各種類型模板,便于快速得到理想的擴增結果

 

圖1

使用PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase以λ DNA為模板擴增長度分別為200 bp、600 bp、800 bp、1 kb、1.2 kb、2.0 kb的目標片段,延伸時間設置為1秒。所有片段均可以實現特異性高產量擴增。

圖2

使用PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase以λ DNA為模板擴增長度分別為5 kb、8 kb、10 kb、12 kb、15 kb的目標片段,延伸時間設置為3分鐘。所有片段均可以實現特異性高產量擴增。

圖3

使用LacI法測定,Phanta?保真性是普通Taq DNA聚合酶的52倍,是野生型Pfu DNA聚合酶的6倍。

(Cline et al. , Nucleic Acids Research,24: 3546-3551(1996))

Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase是一種基于Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶,具有極高的擴增效率和廣泛的模板適應性,可用于幾乎所有PCR反應。經過對Pfu DNA Polymerase的基因工程改造,Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase的行進性(processivity)得到了大幅度提升,即使是非常復雜的模板,也能準確快速的完成反應。其錯配率是普通Taq酶的1/52,是Pfu酶的1/6,且其擴增速度可以達到15秒/kb。5 × Phanta? SF反應緩沖液對于簡單或復雜模板、短片段或長片段PCR擴增都具有良好的適應性。緩沖液中已經含有10 mM Mg2+(1 × 終濃度為2 mM),可以使用隨酶提供的DMSO或MgSO4對反應體系進行優化。附帶的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的擴增。

組分

P501-d1(100U)

P501-d2(500U)

P501-d3(1000U)

5 × SF Buffer (with 10 mM MgSO4)

1.25 ml

5×P501-d1

10×P501-d1

25 mM MgSO4

1 ml

dNTP Mix (10 mM each)

100 μl

PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)

100 μl

5 × PCR Enhancer

500 μl

DMSO

100 μl

10 × Loading buffer

1.25 ml

-20°C保存

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:擴增效率低,實驗組無擴增條帶。

A1:(1) 引物

檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解;引物設計是否合理,可利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

(2) 模板

長期放置、反復凍融會導致模板斷裂、開環或降解,應使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板;模板GC含量過高會導致DNA的雙鏈無法打開,此時加入PCR Enhancer(貨號P021),可以有效降低解鏈溫度;模板的AT含量過高,可嘗試使用針對高AT的產品(貨號P501/P511);模板為粗品,存在抑制物,建議降低模板濃度(稀釋使用;若樣本為植物葉片,要確保植物為非多糖多酚植物,取新鮮幼嫩的葉片,并將葉片面積剪小,如黃槍頭尖部面積大小);若模板為cDNA,要確認逆轉錄所用RNA的純度及完整度。

(3) 酶

反應所用的酶因保存或運輸不當而失活,建議更換新酶或用另一來源的酶重新實驗。

(4) 擴增體系

反應體系配制錯誤,建議重復實驗。

(5) 反應程序

檢查變性溫度是否準確,PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,如果溫度過高,酶在前幾個循環就迅速失活,溫度過低則模板變性不徹底;若模板為酵母菌,可將預變性時間延長10min;退火溫度不合適,可對退火溫度設置梯度,摸索最佳的退火溫度;如果目的片段較長,可嘗試Touch Down 程序;檢查延伸時間是否充足。

(6) Mg2+濃度不合適

Mg2+濃度過低可影響PCR產量甚至使PCR擴增失敗;Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性,應適當調整Mg2+濃度。

Q2:擴增的條帶亮度不太亮。

A2:(1) 引物

檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解。

(2) 模板

首先確認模板的質量,長期放置、反復凍融會導致模板斷裂、開環或降解,應使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板;如果模板沒有了,可用首次擴增產物按倍比稀釋后作為模板進行二次擴增。

(3) 酶

可適當提高酶的使用量。

(4) 反應程序

可嘗試使用Touch Down程序;延長延伸時間,提高循環數。

Q3:擴增特異性差,非特異性擴增。

A3:(1) 引物

引物設計不夠優化。引物與靶序列有非特異性互補或自身聚合成二聚體,可降低引物濃度進行優化,必要時重新設計引物。

(2) 模板

模板不純,被污染,需重新制備模板。

模板降解或過量,通過電泳檢查模板完整性及濃度,必要時重新純化模板。模板的使用量請參考說明書。

(3) 反應程序

反應程序不夠優化。如果出現比目的條帶小的雜帶,可通過提高退火溫度,降低循環數調整;如果出現比目的條帶大的雜帶,可縮短延伸時間、降低循環數。

(4) 酶

酶量加入過多。高保真系列:50μl體系加1U。

Q4:擴增產物跑膠條帶彌散或拖尾。

A4:(1) 膠

制膠時要使膠完全融化。

(2) 引物

檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解。

(3) 模板

模板降解或過量,可通過電泳檢查模板完整性及濃度,必要時重新制備模板。模板的使用量請參考說明書。如果目的條帶較長,模板是cDNA,要確認逆轉錄所用RNA的純度及完整度,逆轉錄時不加隨機引物重新逆轉錄。

(4) 反應程序

反應程序不夠優化。退火溫度不合適,可對退火溫度設置梯度,摸索最佳的退火溫度;嘗試Touch Down 程序。

(5) 酶

酶量加入過多。高保真系列:50μl體系加1U。

Q5:空白對照出現擴增產物。

A5:(1) 引物設計不合理

擴增序列與非目的擴增序列有同源性,PCR也可以擴增出非靶序列的序列。

(2) 若擴增產物條帶大小與目的條帶一致,說明有污染

更換新的Mix、水或引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制,減少氣溶膠污染。

(3) 為了避免靶序列受到整個基因組或大片段的交叉污染,操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。

(4) 為了避免靶基因受到空氣中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法減輕或消除污染。

Q6:高保真酶擴增保真性差,存在突變。

A6:高保真酶在PCR時擴增產物有突變,可以從以下幾點來分析:

(1) 模板本身存在突變

檢查模板,若模板是質粒,建議送質粒去測序;若模板是cDNA,建議重復實驗,如果仍有突變,可能是cDNA有問題,建議重新制備cDNA,制備cDNA前檢測RNA的完整度及純度。

(2) 模板反復凍融

重新制備模板。

(3) 模板長時間在紫外光下照射,引入突變

切膠回收過程中避免長時間在紫外光下照射。

(4) 基因序列與NCBI上的不一致

建議再重復一次送去測序,若結果和上一次一樣,說明序列可能和NCBI上的不一致。

(5) 少量序列存在非嚴謹序列

有相似重組序列,導致重組錯位。

Q7:條帶大小與理論不符。

A7:(1) 實驗體系污染

建議使用全新的試劑和槍頭,對工作臺進行清潔。

(2) 模板或引物使用錯誤

建議更換模板和引物。

(3) 存在基因亞型

建議對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。

Q8:擴增產物跑膠時加樣孔很亮,目的條帶很暗。

A8:可能是循環數過多一些非特異性條帶、蛋白、目的條帶混合在一起形成大分子聚合物跑不下來。可向PCR產物中加入SDS,95℃加熱5min,再跑膠。也可擴大體系,多擴幾管,最后切膠一起回收。

Q9:逆轉錄后的產物cDNA作為模板,使用P505,一次應該加多少體積?

A9:說明書建議cDNA模板使用量為1-5μl(不超過PCR反應總體積的1/10),可在這個范圍內嘗試不同的使用量,摸索最佳使用量。

Q10:高保真酶擴增完的產物是否帶A,若后面要做TA克隆該如何進行?

A10:高保真酶擴增完的產物不帶A,可嘗試使用Vazyme無縫克隆產品C112/C113/C115;若后面做TA克隆可用普通的Taq酶進行加A反應。

具體加A方法:在10μl體系中,加入純化后的PCR產物1-7μl,同時加入1μl 10×Taq Buffer(含MgCl2)、0.5μl 10mM dNTPs、0.2μl Taq DNA聚合酶(不加引物),最后用超純水補足體系,72℃反應10-15min即可。

暫未實現,敬請期待
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