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T7 High Yield RNA Transcription Kit
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T7 High Yield RNA Transcription Kit

貨  號:
TR101-01/02
價  格:
2300.00
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T7 High Yield RNA Transcription Kit

用于體外RNA 合成

優化的反應體系

每個反應產生高達150-200 μg的RNA產物

圖1. 逆轉錄方案

圖2. 反應時間與產量的關系

圖3. 模板投入量與產量關系

 

T7 High Yield Transcription Kit 是優化的體外轉錄試劑盒,T7 RNA Polymerase 從模板DNA T7 的啟動子下游開始合成與DNA 中一條鏈互補的RNA,簡單快速獲得大量的RNA 分子,轉錄時可在底物中加入修飾的核苷酸,制備生物素或染料標記的RNA。本試劑盒以0.5μg 的模板投入量可以產生150 μg-200 μg 的RNA,轉錄合成的RNA 可用于諸如RNA 結構與功能研究、RNA酶保護、探針雜交、RNAi、顯微注射及體外翻譯等多方面的下游應用。

組分

TR101-01(50 rxn)

TR101-02(100 rxn)

T7 RNA Polymerase Mix

100 μl

200 μl

10 × Reaction Buffer

100 μl

200 μl

ATP Solution

100 μl

200 μl

UTP Solution

100 μl

200 μl

GTP Solution

100 μl

200 μl

CTP Solution

100 μl

200 μl

DNase I

50 μl

100 μl

Control Template (0.5 μg/μl)

10 μl

20 μl

RNase-free H2O

1 ml

2 × 1 ml

-20℃保存

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1: RNA產物片段大于預期。

A1: 如果電泳顯示產物條帶大于預期,可能原因:①質粒模板可能沒有完全線性化;②有義鏈3’端為突出結構;③RNA存在未完全變性的二級結構。

建議確認模板結構,并將電泳方式由瓊脂糖膠換成變性膠來檢測RNA產物。

Q2: RNA產物片段小于預期。

A2: 如果電泳顯示產物條帶小于預期大小,可能原因:①模板序列中包含類似于T7 RNA聚合酶的終止序列;②模板中GC含量高形成高級結構;③RNase污染。

不同的聚合酶識別不同的終止序列,若含是模板中含終止結構,建議嘗試不同的RNA聚合酶。如果模板為高GC,建議加入SSB蛋白,以提高轉錄效率。出現產物條帶與預期不一致,請跑變性膠檢測產物。

Q3:產物電泳拖尾現象。

A3: 電泳過程中有拖尾現象,可能原因:①實驗操作過程被RNA酶污染;②DNA模板被RNase污染。體系中的RNA酶抑制劑只能抑制痕量的RNA酶殘留,建議重新純化模板DNA,并在實驗過程中使用RNase-free的槍頭和EP管,佩戴一次性乳膠手套和口罩,所有試劑均用RNase-free H2O配制。

Q4:模板中間有一段Poly T中止序列,后面的序列可以轉錄出來嗎?

A4:模板中有發卡結構會影響轉錄,序列一般不會影響轉錄。

Q5:使用TR101時的模板一定要是雙鏈嗎?

A5:至少T7啟動子要是雙鏈的。

Q6:合成的RNA如何純化?是否有配套的過柱純化盒子?

A6:我們沒有配套的過柱純化盒子。建議選擇使用磁珠純化。

Q7:體外轉錄試劑盒可以轉錄100bp的片段嗎?

A7:只要模板如下圖所示,可以轉錄。如果沒有GGG,轉錄效率會很低。

Q8:使用線性化的質粒時,線性化質粒的方法有哪些?

A8:酶切(注意選擇酶切位點時不要選擇3’端突出的酶切位點)、反向PCR(得到的就是PCR產物)。

Q9:使用質粒作為模板時,在線性化的過程中,為什么需要使用平末端或者5’突出末端的限制性內切酶進行線性化?

A9:原因和環狀質粒為模板相似,都是會因為沒有終止子而無限循環下去,從而導致生成的產物片段大小不一。

Q10:sgRNA條帶模糊。

A10:sgRNA是100nt左右的單鏈RNA,在水溶液中容易形成二級結構,因此電泳時會位置會發生變化,采用加速冷凍或者甲酰胺變性凝膠電泳可以改善電泳結果。

Q11:體外轉錄試劑盒適用的片段范圍是多少?

A11:最小做過21bp的siRNA(TR102),最大做過10kb。

Q12:針對大片段和小片段,轉錄的效率如何?

A12:大片段會出現條帶彌散的情況,因為片段越長酶越容易從模板上脫落,所以得到的產物條帶就不是那么集中,其他競品公司的產品也會出現類似的情況。短的模板小于300nt的,較短的轉錄其實對反應有抑制作用,所以要適當延長反應時間,可以過夜16h。因為模板和酶進行結合時識別啟動子的過程需要時間,所以模板太短時會對反應造成抑制作用,同時建議增加模板量至2μg。

Q13:模板中存在高級結構(高GC或是莖環結構),怎么做可以提高產量?

A13:提高溫度,如果有很多高級結構存在可以建議加入SSB蛋白。

Q14:模板中存在類似于T7終止序列(也是一種莖環結構)怎么做可以提高產量?

A14:降低反應溫度。

Q15:產物純化方式比較。

A15:酚/氯仿抽提的優點是便宜,但是有可能會殘留游離的核苷酸。柱提法優點可以將游離的核苷酸去除干凈,但價格相對較貴。切膠回收的方法得到的產物更加均一。磁珠法優點是快速且回收效率高,可達到90%以上。

Q16:得到的產物量無法達到說明書說的100-150ug可能的原因及建議。

A16:(1) 產物長度小于300nt時,建議提高產物的投入量至2μg,適當延長反應時間。

(2) 陽性對照,試劑盒中提供的陽性模板大小在500bp左右,對于陽性對照的實驗設計可以在選擇反應2h后從20μl的體系中取出5-10μl確定產量,剩下的體積繼續反應至實驗組的反應時間相同后確定產量。

(3) 不同的純化方式產生的損失是不同的。

(4) 可以重新純化模板。

(5) 確定模板定量以及其完整性。

(6) 嘗試其它的啟動子和RNA聚合酶。

Q17:TR101可以用于合成mRNA嗎?

A17:可以,但是要自己購買帽子類似物,說明書中提供的加帽RNA體系就是合成mRNA的體系,里面GTP和加帽類似物的濃度比例建議為1:4。

Q18:模板投入量增加為2μg時,NTP的量以及DNA酶的量是否需要調整?

A18:模板投入量增加為2μg時,NTP的量不用調整,若擔心模板消化不徹底,可將DNA酶的量從1μl提高至3μl;

Q19:對照組投入0.5μg產出是多少?

A19:Control Template的長度約500bp,投入0.5μg,產出約150-200μg,最低130μg(轉錄后直接用Qubit測量濃度)。

暫未實現,敬請期待
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貨  號
EN301-01/02
貨  號
EN303-01/02
貨  號
TR102-01/02
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