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TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

貨  號:
A111-01/02/03
價  格:
1580.00
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TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

綠色熒光檢測凋亡

經過優化FITC-12-dUTP 與未標記dNTP 的比例,提高了熒光檢測的信噪比和靈敏度

高活性的重組TdT 酶保證熒光摻入效率

適用于細胞爬片、石蠟切片和冰凍切片

圖1. 果蠅三齡幼蟲視盤(eye disc)

凋亡誘導基因Hid 在特異性啟動子驅動下在果蠅視盤的遠端誘導出大量凋亡細胞。A. TUNEL 染色,標記凋亡細胞。B. ELAV 染色,標記所有的感光細胞。C. Merge

圖2. 人睪丸組織切片經DNase I 處理

A. TUNEL染色,標記凋亡細胞。B. PI染色,標記所有細胞核。C. Merge。

細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體的DNA 被內源核酸內切酶有規律的降解成長度約為180 bp-200 bp 的整倍數的片段。本試劑盒采用TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法,應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 在凋亡細胞斷裂的DNA的3’- 羥基(3’-OH) 末端催化摻入熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP)。FITC-12-dUTP 標記的DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。試劑盒對標記反應進行了優化,采用最佳比例的FITC-12-dUTP 和未標記dNTP 進行3’-OH 末端的核苷酸摻入,使得同一個斷裂的DNA 片段末端可以形成更長的“標記尾巴”。該“標記尾巴”減少了相鄰摻入dNTP 上標記基團的空間位阻,增加每個斷裂片段上的熒光基團數目,降低熒光基團相鄰后可能造成的聚集和淬滅,從而提高檢測靈敏度,減少非特異性反應。

經過優化FITC-12-dUTP 與未標記dNTP 的比例,提高了熒光檢測的信噪比和靈敏度,高活性的重組TdT 酶保證熒光摻入效率,適用于細胞爬片、石蠟切片和冰凍切片。

組   分

  A111-01 (20 rxn)    

A111-02 (50 rxn)        

A111-03 (100 rxn)

5 × Equilibration Buffer 

1.25 ml  

1.25 ml × 2

1.25 ml × 3

FITC-12-dUTP Labeling Mix

100 μl     

250 μl

250 μl × 2

Recombinant TdT Enzyme

20 μl

50 μl

50 μl × 2

Proteinase K (2 mg/ml)    

40 μl     

100 μl      

100 μl × 2

DNase I (2 U/μl)      

5 μl  

13 μl  

25 μl

10 × DNase I Buffer

100 μl 

260 μl 

500 μl

-20℃保存;FITC-12-dUTP Labeling Mix避光儲存于-20℃。

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:細胞形態很模糊,熒光很少,背景值很高。

A1:(1) 延長細胞通透時間,操作過程中注意保持濕潤,最后觀察是加PBS潤洗。

(2) 洗片過程中可以加Triton進行洗滌。

(3) 注意PI不要過曝,建議曝光時間1-5 s,稍微調低一點曝光。

(4) 嘗試延長37℃孵育時間,剪一小片封口膜把液體蓋上,防止干片。

(5) 同時做陰陽性對照排除試劑盒、操作手法和細胞本身的問題。

Q2:做免疫組化和TUNEL共染,結果不理想。

A2:建議實驗中最后一步用PBS清洗,降低背景值,且操作過程中一定要保持樣品干燥。

Q3:怎樣區分非特異性和特異性染色。

A3:同時做陰性/陽性對照。

Q4:陽性做不出來。

A4:如果是難操作樣本,推薦延長FITC染色時間至2小時,并進行拍攝參數優化。如果排除樣本本身的問題,一般陽性做不出來主要有通透,陽性處理和標記孵育等方面出現問題。陽性處理中要注意Buffer用ddH2O稀釋,酶要用buffer稀釋,酶孵育時間10分鐘。最好,再注意一下標記液是否配置正確,孵育的時候有沒有干片等。

Q5:如何確定可檢測樣本范圍?

A5:TUNEL檢測的是晚期凋亡,所以只要有晚期凋亡,一般都可使用。

Q6: 在整個tunel實驗中,是否可以中止實驗,過夜處理?

A6: 建議不要中止,如果必須中止,標記結束后,放在4℃冰箱過夜處理。

Q7:細胞固定時將75 %乙醇錯加成了100 %,樣本是否可以使用?

A7:不能用,高濃度的乙醇會使細胞迅速皺縮,樣本會迅速脫水,影響固定的效果。

Q8:高背景(如未凋亡細胞的強綠色熒光背景)或綠色熒光點不在背景染色范圍。

A8:(1) 非特異性摻入FITC-12-dUTP。

處理方法:在操作過程中保持細胞濕潤;標記反應完成,載玻片在用PBS洗一遍之后,可再用含0.1% Triton? X-100和5 mg/ml BSA的PBS洗3次,每次5 min。

(2) 脫蠟不徹底,FITC與蠟相結合,導致高背景

(3) 組織樣本不干凈,含有血液及脂肪等雜質,與FITC結合后形成高背景

Q9:陽性細胞數量少。

A9:通透不充分,可通過調整蛋白酶K或Triton? X-100的孵育時間優化通透步驟。

Q10:組織切片從載玻片上脫落。

A10:組織切片粘附之前的包被不充分。在展片之前,用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane,TESPA;Sigma Cat.# A3648)包被顯微鏡載玻片比多聚賴氨酸(poly-L-lysine)效果更好。

Q11:顯微鏡或流式細胞儀分析只剩下很少的細胞。

A11:在操作過程中丟失大量細胞。①可以提高起始的細胞量;②在制備細胞懸液時,離心過程中用含1% BSA的PBS洗細胞。

Q12:標記率低。

A12:如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低(因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯,而在操作中丟失),應用溶于1 ×PBS(PH7.4)中的4%多聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。過度的固定導致與蛋白過度交聯也會導致標記效率低,可以適當縮短固定時間;或用溶于1 ×PBS(PH7.4)的2%多聚甲醛固定。

Yu W, Zhang Z, Min D, et al. (2014). Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 19 promotes osteosarcoma growth and metastasis and associateswith prognosis. Eur J Cancer, 50(6):1125-1136. IF:5.061
Xu C, Yu L, Hou J, et al. (2017).Conditional Deletion of PDK1 in the Forebrain Causes Neuron Loss and Increased Apoptosis during Cortical Development[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience, 2017, 11:330.IF:4.555
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