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Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit
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Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

貨  號:
A213-01/02
價  格:
1200.00
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Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit 

  • 染色特異性強

  • PE染料為紅色熒光,可與綠色熒光實現共染

圖1. Annexin V-PE/7-AAD染色檢測凋亡效果圖

圖 A. 未經喜樹堿誘導的Jurkat 細胞,用Annexin V-PE 和7-AAD雙染后流式二維圖(左)與直方圖(右);

圖 B. 用終濃度為4 μM 的喜樹堿誘導Jurkat 細胞凋亡4 h,用Annexin V-PE 和7-AAD雙染后流式二維圖(左)以及直方圖(右)。

圖2. Annexin V-PE/7-AAD染色檢測不同程度凋亡

用喜樹堿(Camptothecin,CPT)誘導Jurkat細胞(人T淋巴瘤細胞)凋亡,誘導濃度分別為0、4、8、12、16μM,分別誘導4小時后,參照產品說明書實驗方案進行染色,用流式細胞儀檢測結果如圖2。

(A)0μM. (B)4μM.(C)8μM.(D)12μM.(E)16μM.(F)競爭封閉實驗,采用16μM CPT誘導Jurkat細胞4小時后,參照說明書收集并洗滌細胞,于染色前加入無染料標記的Annexin V蛋白孵育10分鐘,再進行Annexin V-PE/7-AAD染色。無染料標記的Annexin V結合了細胞上的PS,再進行染色時,Annexin V-PE無法結合PS,這說明了染色的特異性。

在正常細胞中,磷酯酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜中的PS由內側外翻至外側,從而將PS暴露于細胞外部環境。Annexin V是一種35 - 36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,與PS具有高度親和力,故可通過細胞外側暴露的PS與凋亡早期細胞的細胞膜結合。因此Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

將Annexin V以藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)進行標記,標記后的Annexin V保留了與PS的高親和力,可作為探針,利用流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測。由于在凋亡早期即發生PS外翻,故Annexin V-PE染色在凋亡早期就能識別出凋亡的發生。7-氨基放線菌素(7-AAD)是一種核酸染料,7-AAD不能透過正常細胞或早期凋亡細胞完整的細胞膜,但可穿透膜損傷細胞如晚期凋亡細胞或者壞死細胞的細胞膜并與其內的DNA結合,可用來區分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞或壞死細胞。因此將Annexin V-PE與7-AAD進行共染,就可以區分不同凋亡時期的細胞。

組分

A213-01(50 rxn)

A213-02(100 rxn)

Annexin V-PE

250 μl

500 μl

7-AAD Staining Solution

250 μl

500 μl

1 × Binding Buffer

25 ml

2 × 25 ml

本試劑盒所有組分均在2 - 8℃保存,Annexin V-PE和7-AAD Staining Solution需避光保存,勿冷凍。

 

 

 

 

 
未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:Annexin V-PE染色失敗或者陽性率偏低。

首先要確定實驗中使用的誘導劑是否能產生凋亡。可通過設定確切凋亡誘導效果的陽性藥物對照來排除這一情況。

Annexin V-PE染色失敗,最常見的實驗操作原因是貼壁細胞消化不當。Annexin V跟PS的結合需要Ca2+,Binding Buffer中含有2.5 mM的Ca2+,含EDTA的胰酶消化會影響染色,建議使用無EDTA的胰酶。若使用含EDTA的胰酶,必須通過洗滌步驟徹底去除EDTA。

用PBS洗滌細胞沉淀后,應盡量去除殘余液體。殘留PBS中的磷酸根,會形成磷酸鈣沉淀。

Binding Buffer的瓶蓋要緊閉,防止空氣中的CO2進入后形成碳酸鈣沉淀,減少游離Ca2+,導致實驗失敗。

接觸其他緩沖液如吸取PBS后不更換槍頭也會導致游離的Ca2+減少。

一些細胞其細胞膜上PS的密度較低,染色效果很差,此時建議更換細胞株或者采用TUNEL試劑盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd-A111/A112/A113)檢測凋亡。

如果是貼壁細胞,藥物誘導后漂浮的細胞也要收集,這部分細胞往往是凋亡陽性的細胞,丟棄會造成陽性結果偏低。

 

Q2:假陽性

實驗中發現未經誘導凋亡的對照細胞經染色后Annexin V-PE/7-AAD雙陽性比例過高,造成這種結果的原因可能是細胞本身活力低。建議用臺盼藍染色計算細胞活力,陰性對照臺盼藍拒染的細胞應大于95%。若細胞活力低,建議重新復蘇細胞,通常剛復蘇的細胞至少應傳代2 - 3次以后才能進行實驗。

另一可能是細胞操作不當引起,操作過程中吹打細胞過于劇烈,貼壁細胞消化過程中消化時間過長,均可能導致細胞膜破壞,出現假陽性。

此外,一般情況下誘導幾個小時就可以出現早期凋亡,因此通常不需要處理大于48 h以上;誘導時間過長會使營養物質耗盡,導致細胞狀態差,假陽性結果偏高。

 

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