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Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2
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Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2

貨  號:
C215-01/02
價  格:
1280.00
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Mut Express? MultiS Fast Mutagenesis Kit V2

一步法多點突變試劑盒

Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase提供突變率最低的高保真PCR

Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase卓越的長片段擴增能力,廣泛適用于20 kb以內任何質粒的擴增

擴增以指數方式進行,模板使用量極低,有利于原始甲基化模板的徹底降解

ClonExpress?快速克隆系統高效環化PCR產物

DpnI消除原始模板污染

可一步實現目標質粒上三至五個不連續位點(相距超過50 bp)的定點突變

使用Mut Express? MultiS 進行不連續三點突變實驗流程:

以待突變位點A、B、C 為界,將質粒分為AB、BC 和CA 三段。在每個待突變位點處設計部分反向互補的引物。以原始質粒為模板,分別擴增AB 段(A Forward Primer 和B Reverse Primer)BC 段(B Forward Primer 和C Reverse Primer) 和CA 段(C Forward Primer和A Reverse Primer) (I)。擴增產物經DpnI消化(I) 后,進行重組環化(II)。重組產物直接進行轉化即可完成定點突變(III)。

 

Mut Express? MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 是基于ClonExpress? 快速克隆技術的多位點定點突變系統。使用本試劑盒,可一次性向目標質粒上三至五個不連續位點同時引入定點突變。該試劑盒由Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase 擴增模塊和ClonExpress?快速克隆模塊組成。Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase 超高的保真度顯著降低了擴增過程中引入新突變的可能性。ClonExpress? 快速克隆系統利用高效同源重組技術替代了傳統的退火成環反應,大大提高了環化效率。使用Mut Express? MultiS 定點突變試劑盒進行DNA 定點突變時,引物設計靈活、模板需求量低,且如擴增產物特異,DpnI 消化后可不進行DNA 純化而直接用于重組反應。專門針對多位點定點突變而優化的重組酶、高度優化的反應緩沖液、快捷的操作流程以及驚人的定點突變效率,使得Mut Express? MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 成為DNA 多點突變首選試劑盒。

 

組分

C215-01 (10 rxn)

C215-02 (25 rxn)

2 × Max Buffer

1.25 ml

3 × 1.25 ml

dNTP Mix (10 mM each)

50 μl

125 μl

PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase

50 μl

125 μl

DpnI (10 U/μl)

50 μl

125 μl

5 × CE MultiS Buffer

40 μl

100 μl

ExnaseMultiS

20 μl

50 μl

- 20℃儲存

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:質粒模板無法正常擴增。

A1:(1) 引物設計有誤:核對引物設計方案;

(2) 擴增體系配制錯誤:重復實驗;

(3) 擴增反應條件不優化:調整Mg2+濃度、酶量、擴增程序;

(4) 模板質粒質量偏差:長期放置、反復凍融會導致模板質粒斷裂、開環或降解,應使用新鮮制備的質粒作為模板。

Q2:平板上長不出克隆或者克隆數很少。

A2:(1) 感受態效率低:使用新制備或妥善凍存的感受態細胞,確保轉化效率需107 cfu/μg。每次可設置一組轉化質粒的對照試驗,以檢測感受態細胞的轉化效率;

(2) 重組反應體系中DNA量不足或比例不佳(雙堿基突變):盡量按照說明書推薦的量配置重組體系。請務必預先檢測DpnI消化產物的濃度。常用的吸光度測量法極易受DNA純度、DNA稀釋液pH等因素影響,測定值和DNA實際濃度往往偏差非常大;

(3) 重組環化反應體系中DNA不純,抑制反應:未純化DpnI消化產物加入重組體系內的總體積不應超過4ul(反應體系體積1/5)。嘗試對DpnI消化產物進行膠回收純化。重組反應體系中應盡量避免金屬絡合劑(如EDTA)的帶入。因此,我們推薦您將DNA純化產物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常規膠回收試劑盒中的洗脫液可用8.0的ddH2O替代),請勿使用TE進行DNA保存;

(4) 感受態細胞中加入了過多的反應產物:反應產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率; 

(5) 出現轉化抑制效應:當轉化的DNA濃度太高時,會抑制轉化反應,將重組反應產物稀釋5倍后取1/5進行轉化。

Q3:定點突變未正確完成。

A3:(1) 引物設計錯誤:核對引物設計方案;

(2) 擴增反應所用模板為非甲基化的質粒:DpnI只能識別甲基化DNA,請務必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴增的質粒作為PCR模板;

(3) 擴增反應使用過多的模板質粒:對大多數質粒,1ng模板量已足以使擴增反應正常進行,過多的質粒模板將會導致DpnI消化不完全,降低突變成功率。

Q4:非目標位點突變。

A4:(1) 模板質粒攜帶未知位點突變:測序確認模板質粒序列正確性;

(2) 擴增循環數過多:為了防止擴增過程中引入非目標突變,擴增循環數不宜超過35。如果擴增效率良好的話,推薦擴增循環數應不超過30。

Xu D, Zhang T, Xiao J, et al. (2015). Modification of BECN1 by ISG15 plays a crucial role in autophagy regulation by type I IFN/interferon. Autophagy, 11(4):617-628. IF:11.753
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