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ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit
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ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit

貨  號:
C113-01/02
價  格:
520.00
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ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit 

非連接酶依賴型的多片段一步克隆技術

  • 可在幾乎任何載體的任意位點進行多片段拼接克隆

  • 無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點

  • 可一次實現二至五個插入片段的順序拼接

  • 線性化克隆載體和 PCR 產物可不進行純化直接克隆

  • 提供引物設計軟件CE Design

酶切鑒定,克隆陽性率達到95%以上

ClonExpress? MultiS是針對多片段克隆開發,試劑盒中包含專門針對多片段重組優化的buffer和重組酶Exnase? MultiS。首先將載體進行線性化,并在插入片段PCR引物5'-端引入線性化載體的末端序列;之后將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產物和線性化載體按一定比例混合后,在Exnase?的催化下,僅需反應30 min即可進行轉化,完成定向克隆,陽性率可達95%以上。使用本試劑盒,可以將多至五個片段一次性順序拼接,極大簡化了實驗步驟。

組分

C113-01(10 rxn)

C113-02(25 rxn)

5 × CE MultiS Buffer

40 μl

100 μl

Exnase?MultiS

20 μl

50 μl

pUC19 control vector,linearized (50 ng/μl)

5 μl

5 μl

Control insert Mix*

5 μl

5 μl

* 0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl

- 20℃保存

 

 

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:引物如何設計?

A1:(1) 引物設計:官網引物設計軟件CE Design V1.04,選擇相應模塊進行設計;

(2) 載體的線性化方式有三種:雙酶切、單酶切和反向PCR,優先選擇雙酶切;

(3) 引物由三部分組成:同源臂(15-20 bp,不計算酶切位點和殘留堿基,GC含量40%-60%)+酶切位點(根據實驗需求保留或舍棄)+特異性引物(引物Tm值的計算不包括同源臂的序列)。

Q2:平板上長不出克隆或者克隆數很少。

A2:(1) 引物設計不正確:引物包含15-20 bp同源臂(不計算酶切位點),GC含量40%-60%;若同源臂的GC含量過高或過低,可重新選擇插入位點;

(2) 線性化克隆載體和插入片段擴增產物的使用量不足/過量,即比例不佳:盡量按照說明書推薦的量和比例配置重組體系;

(3) 重組體系不低于10 μl,各組分添加不低于1μl(避免低體積添加造成量取不準);若載體或片段濃度過低導致添加量超過20 μl,可同比例降低載體和片段的添加量;插入片段長于載體時,重組體系中片段與載體的摩爾比為2:1;

(4) 載體和插入片段不純,抑制反應:未純化DNA不應超過4 μl(反應體系體積的1/5);建議線性化載體和PCR產物進行膠回收純化,純化產物溶解在pH 8.0的ddH2O保存;

(5) 感受態細胞的轉化效率需大于107 cfu/μg,重組產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率;選擇克隆用感受態細胞(如DH5α/XL10),不能選擇表達用感受態細胞;

(6) 酶切獲得的載體應經加熱處理失活限制性內切酶,對于加熱處理不能失活的酶切體系,必須經過膠回收純化;

(7) 核查基因是否致死。

Q3:多數克隆含有不正確的插入片段。

A3:PCR產物混有非特異性產物:優化PCR體系,提高特異性;膠回收PCR產物;鑒定更多的克隆。

Q4:插入片段出現堿基突變。

A4:插入片段在PCR獲得時使用高保真的聚合酶;若突變發生在同源臂區域,請進行引物序列核對。

Q5:多數克隆不含插入片段。

A5:(1) 克隆載體線性化不完全:可通過陰性對照檢測載體是否線性化完全;對于優化酶切體系,提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物;

(2) 插入片段獲得的PCR體系中混入了相同抗性的質粒:PCR擴增模板為環狀質粒時,如擴增產物直接用于重組反應時需進行DpnI消化,或者進行膠回收純化。

Q6:陽性對照不長斑或很少。

A6:(1) 平板抗性使用錯誤:試劑盒中提供的對照載體的抗性為A+抗性;

(2) 感受態細胞效率低:確保轉化效率>107cfu/μg,可進行簡單檢測,將1 ng質粒轉化至100 μl感受態細胞中,取1/10進行涂板,生長1000個菌斑,估算感受態轉化效率為107cfu/μg;重組產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率;感受態選擇克隆感受態(如DH5α/XL10),不能用表達感受態。

Q7:菌液PCR無條帶。

A7:(1) 引物不正確:建議使用載體的通用引物進行菌檢,或至少使用一條通用引物;

(2) PCR體系或程序不合適:沒有目的條帶也沒有空質粒條帶,建議優化PCR體系、程序;或者提取質粒,以質粒做模板PCR驗證,或著進行酶切驗證;

(3) 重組失敗:只有空質粒的條帶,說明重組不成功,載體線性化不完全,建議優化酶切體系。

Q8:菌種(表達用)保存一段時間后出現表達量下降。

A8:菌種在保存過程中,可能會出現質粒丟失,拷貝數降低的情況,重新培養時適當增加抗生素的濃度,篩選出含高拷貝數質粒的細菌。

暫未實現,敬請期待
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貨  號
P515-01/02/03
貨  號
MD101-01/02
貨  號
MD102-01/02
貨  號
MD103-01/02
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