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HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit

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R111-01/02
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630.00
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HiScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit

cDNA 一鏈合成試劑盒

HiScript? Reverse Transcriptase 提供可靠的逆轉錄表現

寬泛的模板量范圍,可成功逆轉錄從10 pg-5 μg 總RNA

高效的合成能力:可合成長達10 kb 的cDNA

針對不同下游應用可選擇不同引物,合成的一鏈cDNA 可廣泛應用于分子克隆、雜交、PCR 擴增及qPCR 反應等。

以HeLa 細胞總RNA 為模板,使用Vazyme #R111 分別和其他公司的逆轉錄試劑Supplier T,Supplier G 在各自說明書所提供的反應體系及反應條件下逆轉1 pg-1 ug 總RNA,用qPCR 檢測基因ACTB。結果顯示,與同類產品相比,Vazyme #R111 呈現良好的線性關系,并且檢測靈敏度低至1 pg。

本產品是使用HiScript?Reverse Transcriptase 從Total RNA 或Poly (A)+ mRNA 合成1st Strand cDNA 的試劑盒。HiScript?Reverse Transcriptase 是在M-MLV (Moloney Murine Leukemiavirus) 基礎上經過多點突變得到的新型逆轉錄酶。該酶能夠有效合成長達10 kb 的cDNA,適用于常規RNA、富含GC 區域或具有復雜二級結構RNA 模板的逆轉錄。本產品基于HiScript?Reverse Transcriptase,包含合成高質量第一鏈cDNA 所需的所有成分,適合于后續的PCR、qPCR 實驗。

組分

R111-01 50 rxn (20 μl/rxn)

R111-02 100 rxn (20 μl/rxn)

RNase free ddH2O

1 ml

1 ml

2 ×RT Mixa

500 μl

1 ml

HiScript? Enzyme Mixb

100 μl

200 μl

Oligo(dT)18 (50 μM)

50 μl

100 μl

Random hexamers (50 ng/μl)

50 μl

100 μl

-20℃保存。
 

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:原核生物RNA能用我們的逆轉錄試劑嗎?

A1:可以。原核生物RNA沒有polyA尾,所以在逆轉錄反應體系中需要以Random primer作為逆轉錄引物。

Q2:逆轉錄試劑盒中帶有gDNA wiper Mix,可以去除殘留在RNA中的基因組。最多可以去除多少的基因組?但如果不進行基因組去除,會影響接下來的逆轉錄嗎?

A2:我們做過100ng基因組的測試,去除效率是99.95%。如果不進行基因組去除不會影響逆轉錄實驗的進行,但是如果基因組殘留嚴重但不去除的話,會影響接下來定量實驗的準確性。

Q3:延長逆轉錄時間,是否可以提高逆轉錄效率?

A3:對于大多數基因,延長逆轉錄時間對逆轉錄效率并沒有顯著提升;對于一些GC含量較高或含高級結構的模板,延長逆轉錄時間可提升逆轉錄效率。

Q4:做了No RT Control發現有gDNA殘留怎么辦?

A4:如果使用試劑盒中的gDNA wiper模塊進行gDNA去除,但No RT Control仍有CT值,可通過實驗組和No RT Control組的CT值來判斷實驗數據是否可用。當實驗組CT值與No RT Control對照組CT值差值大于5,說明由gDNA導致的誤差小于5%,則可以忽略gDNA污染;若實驗組與對照組CT值差值小于3或者幾乎一致,則實驗組擴增產物的模板很大一部分來源于gDNA,這樣的實驗組就失去定量意義。

Q5:如何評判RNA質量?

A5:RNA質量從兩個方面反應:

(1) RNA完整度。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整度。以真核生物為例,完整的總RNA有清晰的三條帶,分子量從大到小分別為28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的兩倍;若能看見三條帶,但帶型模糊或彌散,則說明RNA有部分降解,此時請立即進行逆轉錄反應,并適量加大模板量;若只能看見分子量很小的一條帶或沒有條帶,則 RNA 已完全降解,需要重新提取。

(2) RNA的純度。RNA的純度可以通過OD260/280和OD260/230兩個比值是否在1.8-2.1范圍內進行判斷,蛋白、離子等殘留會使比值降低。

Q6:如何選擇逆轉錄的引物?

A6:根據實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT或基因特異性引物進行逆轉錄。

(1) 隨機引物:隨機結合在RNA的任何區域,適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA類型的逆轉錄反應。

(2) Oligo dT:適用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT結合在PolyA尾上,所以對 RNA 樣品的質量要求較高,即使有少量的降解也會使全長cDNA合成量大大減少。

(3) 基因特異性引物:與模板序列互補,適用于序列已知的基因逆轉錄。

cDNA后續進行PCR擴增長片段,一般用Oligo dT或者基因特異性引物,不建議使用隨機引物,因為隨機引物是隨機結合的,cDNA片段會偏短,可能會對長片段擴增造成稀釋,后續擴增不出全長的目的基因;cDNA后續進行qPCR,一般使用Oligo dT和隨機引物的混合物,可以避免3’端和5’端的擴增偏好性。

Q7:可以通過測逆轉產物cDNA濃度判定逆轉效率嗎?

A7:不可以,逆轉錄產物cDNA是混合物,除了cDNA產物以外,還有buffer、逆轉錄酶、引物,同時還包含未轉錄的模板RNA,總RNA中的tRNA、rRNA等,都會干擾濃度測定結果,因此不能反應真實的cDNA產量。

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