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HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

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R211-01/02
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750.00
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HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 

高效cDNA 一鏈合成試劑盒

基于高效的HiScript? II Reverse Transcriptase,超強的溫度耐受能力確保在高溫條件下能打開RNA 復雜二級結構,得到更長的cDNA

寬廣的模板起始量范圍,從1 pg-5 μg 總RNA,并且可擴增片段長達15 kb 以上

Anchored Oligo(dT) 23 VN 設計結合位點錨定,特異性高,保證第一鏈cDNA 合成效率和成功率

針對不同下游應用選擇不同的引物,合成的一鏈cDNA 廣泛應用于分子克隆、雜交、PCR 擴增及qPCR 反應等

圖1.R211可完整逆轉錄長達20 kb 的RNA 模板

以1 μg HeLa 細胞總RNA 或小鼠骨骼肌細胞總RNA (for Nebulin) 為模板,Oligo(dT) 23 VN為引物進行逆轉錄。

取1 μl cDNA 為模板,用Vazyme LAmp? DNA Polymerase 擴增。

M: DL 15000 Marker。

圖2. R211 對qPCR 具有寬廣且靈敏的線性逆轉錄范圍

以1 μg-1 pg HeLa 細胞總RNA 為模板做逆轉錄,使用Random hexamers 和Oligo(dT) 23 VN 共同逆轉錄,取1 μl cDNA 為模板,分別用AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix 擴增ACTB 基因和CBR3 基因。

本產品是基于高效的HiScript? II Reverse Transcriptase 從總RNA 或Poly (A) + mRNA 合成一鏈cDNA 的試劑盒。含有一鏈cDNA 合成所需的全部試劑,其中HiScript? II Reverse Transcriptase 具有更高的cDNA 合成效率及模板的雜質耐受度,更加適合具有復雜二級結構或低豐度的RNA 模板的逆轉錄。Anchored Oligo (dT) 23 VN 設計結合位點錨定,特異性高,保證第一鏈cDNA 合成效率和成功率。合成的一鏈cDNA 可廣泛應用于二鏈cDNA 合成、雜交、PCR 法擴增等。特別適用于全長cDNA文庫制作、高純度全長cDNA 合成等。

 

組分

R211-01 50 rxn (20 μl/rxn)

R211-02 100 rxn (20 μl/rxn)

RNase free ddH2O

1 ml

1 ml

2 ×RT Mixa

500 μl

1 ml

HiScript? II Enzyme Mixb

100 μl

200 μl

Oligo(dT)23VN (50 μM)

50 μl

100 μl

Random hexamers (50 ng/μl)

50 μl

100 μl

a. 包含1 mM each dNTP。

b. 包含RNase inhibitor。

-20℃保存。

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:原核生物RNA能用我們的逆轉錄試劑嗎?

A1:可以。原核生物RNA沒有polyA尾,所以在逆轉錄反應體系中需要以Random primer作為逆轉錄引物。

Q2:逆轉錄試劑盒中帶有gDNA wiper Mix,可以去除殘留在RNA中的基因組。最多可以去除多少的基因組?但如果不進行基因組去除,會影響接下來的逆轉錄嗎?

A2:我們做過100ng基因組的測試,去除效率是99.95%。如果不進行基因組去除不會影響逆轉錄實驗的進行,但是如果基因組殘留嚴重但不去除的話,會影響接下來定量實驗的準確性。

Q3:延長逆轉錄時間,是否可以提高逆轉錄效率?

A3:對于大多數基因,延長逆轉錄時間對逆轉錄效率并沒有顯著提升;對于一些GC含量較高或含高級結構的模板,延長逆轉錄時間可提升逆轉錄效率。

Q4:做了No RT Control發現有gDNA殘留怎么辦?

A4:如果使用試劑盒中的gDNA wiper模塊進行gDNA去除,但No RT Control仍有CT值,可通過實驗組和No RT Control組的CT值來判斷實驗數據是否可用。當實驗組CT值與No RT Control對照組CT值差值大于5,說明由gDNA導致的誤差小于5%,則可以忽略gDNA污染;若實驗組與對照組CT值差值小于3或者幾乎一致,則實驗組擴增產物的模板很大一部分來源于gDNA,這樣的實驗組就失去定量意義。

Q5:如何評判RNA質量?

A5:RNA質量從兩個方面反應:

(1) RNA完整度。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整度。以真核生物為例,完整的總RNA有清晰的三條帶,分子量從大到小分別為28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的兩倍;若能看見三條帶,但帶型模糊或彌散,則說明RNA有部分降解,此時請立即進行逆轉錄反應,并適量加大模板量;若只能看見分子量很小的一條帶或沒有條帶,則 RNA 已完全降解,需要重新提取。

(2) RNA的純度。RNA的純度可以通過OD260/280和OD260/230兩個比值是否在1.8-2.1范圍內進行判斷,蛋白、離子等殘留會使比值降低。

Q6:如何選擇逆轉錄的引物?

A6:根據實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT或基因特異性引物進行逆轉錄。

(1) 隨機引物:隨機結合在RNA的任何區域,適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA類型的逆轉錄反應。

(2) Oligo dT:適用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT結合在PolyA尾上,所以對 RNA 樣品的質量要求較高,即使有少量的降解也會使全長cDNA合成量大大減少。

(3) 基因特異性引物:與模板序列互補,適用于序列已知的基因逆轉錄。

cDNA后續進行PCR擴增長片段,一般用Oligo dT或者基因特異性引物,不建議使用隨機引物,因為隨機引物是隨機結合的,cDNA片段會偏短,可能會對長片段擴增造成稀釋,后續擴增不出全長的目的基因;cDNA后續進行qPCR,一般使用Oligo dT和隨機引物的混合物,可以避免3’端和5’端的擴增偏好性。

Q7:可以通過測逆轉產物cDNA濃度判定逆轉效率嗎?

A7:不可以,逆轉錄產物cDNA是混合物,除了cDNA產物以外,還有buffer、逆轉錄酶、引物,同時還包含未轉錄的模板RNA,總RNA中的tRNA、rRNA等,都會干擾濃度測定結果,因此不能反應真實的cDNA產量。

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